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标題ELISA測定錯誤結果的原因分析

   

提供者:上海恒遠生物科技有限公司    發布時間:2019/8/1   閱讀次數:154次 >>進入該公司展台
 ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多,而且其操作中有一定的技術要求,在臨床檢驗中除正常反應外,有時常可見到一些錯誤結果(即假陽性或假陰性結果)。引起ELISA測定錯誤結果的原因主要有:①标本因素;②試劑因素;③操作因素。本文就标本因素對ELISA測定的影響做如下讨論。
 
    血清是最常用的ELISA标本,血漿一般可視為與血清同等的标本,标本引起的假陽性和假陰性結果主要是幹擾性物質所緻,分為内源性物質和外源性物質兩種:
 
    一、内源性物質
    有人認為大約40%的人血清标本中含有非特異性幹擾物質,可以不同程度影響檢測結果。常見的幹擾物質有:類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫源性誘導的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應物質和其它物質等。
 
    1.類風濕因子 人血清中IgM、IgG型類風濕因子(RF)可以與ELISA系統中的捕獲抗體及酶标記二抗的FC段直接結合,從而導緻假陽性。解決該情況的辦法是:①用F(ab)2替代完整的IgG;②标本用聯有熱變性(63℃,10 min)IgG的固相吸附劑處理(将熱變性IgG加入到标本稀釋液中同樣有效);③檢測抗原時,可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀釋液中,使RF降解。
 
    2.補體 ELISA系統中固相一抗和标記二抗過程中,抗體分子發生變構,其FC段的補體C1q分子結合位點被暴露出來,使C1q 可以将二者連接起來,從而造成假陽性。解決的辦法是:①用EDTA稀釋标本;②用53℃,10 min或56℃,30 min加熱血清使C1q滅活。
 
    3.嗜異性抗體 人類血清中含有能與齧齒類動物(如鼠等)Ig (s) 結合的天然嗜異性抗體,可将ELISA系統中一抗和二抗連接起來,也能造成假陽性。解決的辦法是:可在标本稀釋液中加入過量的動物Ig (s) ,但加入量不足或亞類不同時無效。
 
    4.嗜靶抗原的自身抗體 抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體,有時能與靶抗原結合形成複合物,在ELISA方法中均可幹擾抗原抗體測定結果。為避免以上情況出現,解決的辦法是:測定前需用理化方法将其解離後再測定。
 
    5.醫源性誘導的抗鼠Ig (s) 抗體 臨床開展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療,用放射性同位素标記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術,均有可能使這些病人體内産生抗鼠抗體;另外,被鼠等齧齒類動物咬傷的病人體内也可以産生抗鼠Ig (s) 抗體。這些病人ELISA測定時均可産生假陽性。解決的辦法是:測定抗原時,在标本中加入足量的正常鼠Ig (s) ,從而克服由于上述原因造成的假陽性。
 
    6.交叉反應物質 類地高辛、類AFP樣物質等,是與靶抗原有交叉反應的物質。在用多抗測定抗原時對測定結果影響不大,但在用單克隆抗體測定抗原時,如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應的靶決定簇時,也會出現假陽性結果。
 
7.标本中其它成分的影響 血清脂質過高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過大等,均對ELISA測定結果有幹擾作用。
 
    二、外源性物質
外源性物質常常是由于用于ELISA測定的血标本的采集、貯存等不當所緻。如标本溶血、标本被細菌污染、标本貯存過久、标本凝集不全和采血管中添加物等影響。
 
    1.标本溶血 由于各種人為原因引起的标本溶血,均可因紅細胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白,在以辣根過氧化物酶為标記的ELISA測定中,會導緻非特異性顯色,幹擾測定結果。為克服上述幹擾作用,标本采集時必須注意避免溶血。
 
    2.标本受細菌污染 因菌體中可能含有内源性辣根過氧化物酶,因此,被細菌污染的标本同溶血标本一樣,亦可産生非特異性顯色而幹擾測定結果。
 
    3.标本保存不當 在冰箱中保存過久的标本,血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體,在間接法ELISA測定中會導緻本底過深、甚至造成假陽性;标本放置時間過長(如一天以上),有時抗原或抗體免疫活性減弱,亦可出現假陰性。為克服上述幹擾,ELISA測定的血清标本宜為新鮮采集;如不能立即測定,5天内測定的血清标本可存放于4℃,1周後測定的血清标本應低溫凍存;凍存後融解的标本,蛋白質局部濃縮,分布不均,應充分混合後再測定,但混勻時應輕柔,不可強烈振蕩。
 
    4.标本凝集不全 在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下,正常血液采集後1/2~2h開始凝固,18~24h完全凝固。臨床檢驗工作中,有時為了争取時間快速檢測,常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清,此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結果;這類情況于次日複查時因血凝已完全,血清中不再有纖維蛋白原存在,故複查結果變為陰性。為避免上述幹擾作用,解決的辦法最好是血液标本采集後必須使其充分凝固後再分離血清,或标本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入适當的促凝劑。
 
    5.标本管中添加物質的影響 抗凝劑(如肝素,EDTA)、酶抑制劑(如NaN3可抑制ELISA系統中辣根過氧化物酶活性)及快速分離血清的分離膠等均對ELISA測定有一定幹擾作用。
 
    綜上所述,對臨床檢驗ELISA測定中出現的假陽性或假陰性結果,在考慮試劑因素和操作因素之外,更多的應從标本因素方面進行分析,并應采取相應措施排除幹擾作用,從而為臨床提供正确可靠的檢測結果。
 
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關鍵詞:ELISA試劑盒  

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