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第一鍊cDNA合成試劑盒

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資料簡介

産品名稱:第一鍊cDNA合成試劑盒
英文名稱:RT EasyTM(For first-strand cDNA synthesis)
産品規格:25 rxns 100 rxns
産品貨号:RT-01011
保存說明:短期室溫,長期2-8℃
産品描述:用于長cDNA合成或者客戶特定引物RT反應
 
英文名稱:RT EasyTM(First-strand cDNA for Real Time PCR)
産品規格:50 rxns 200 rxns
産品貨号:RT-01021
産品描述:第一鍊合成,添加2種引物,用于Real Time PCR
 
 
第一鍊cDNA合成試劑盒注意事項:
1、确保RNA完整性及純度。RNA質量是決定合成cDNA第一鍊成功的關鍵因素,其純度及完整性可由OD260/OD280比值和進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。較純的RNA樣品OD260/OD280比值通常為1.8-2.0,若該比值偏低,應進一步純化。真核生物RNA樣品電泳圖譜28s和18s的比值約為2:1,否則,表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。進行cDNA合成所用的器皿、試劑和溶液必須完全無菌。操作過程始終戴手套以杜絕各種RNA酶的污染。
3、合成cDNA第一鍊的引物選擇。選擇oligo(dT)12-18作為反轉錄引物,可保證cDNA具有完整的3-端,通常可得到接近全長的cDNA第一鍊;若選擇随機寡核苷酸(dN)6或(dN)9作為引物,引物在整個mRNA的多個位點退火,産生短的部分長度的cDNA第一鍊。這種方法經常用于獲得5末端序列及從帶有二級結構區域或帶有逆轉錄酶不能複制的終止位點的RNA模闆獲得cDNA。
 
第一鍊cDNA合成試劑盒操作方法:
1、逆轉錄反應
(1)在無菌薄壁管中加入以下成份:
TotalRNA   0.5-1.0µg
(dN)9oroligo(dT)18 100pmol
(2)混勻後,70℃變性5min,将薄壁管迅速置于冰上冷卻,然後依次加入以下成份:
5×M-MLVBuffer     4µl
dNTPs(10mMeach)    1µl
RNasin        10U
100mMDTT       2µl
M-MLVReverseTranscriptase  100U
DEPC-treatedwater    upto20µl
(3)混勻後短暫離心,使用oligo(dT)18引物時在42℃,使用随機引物(dN)9時在37℃下溫育1小時。
(4)94℃5min終止反應後,冰上冷卻。
(5)合成的cDNA第一鍊可直接用于PCR擴增或進行其它下遊操作。
相關産品:RT-01011    

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